Histoloji Nedir?

  Yunanca histos: doku ve logos: bilgi kelimelerinin birleşmesinden oluşan kelimedir.
  Dokuları inceleyen bilim dalıdır.
  Canlı vücudunu meydana getiren hücre, doku ve organların yapısını, mikroskobik olarak inceler.

  Doku ve organlar, mikroskop altında incelenebilir hale gelmeden önce bir takım işlemlerden geçirilir. Yapılan bu işlemlere histolojik teknikler adı verilir.

  Histolojik inceleme ikiye ayrılır; Canlı(Vital) inceleme, Cansız(Ölü) İnceleme

  A) Canlı(Vital) İnceleme

  Canlı hücre veya organizmalar üzerinde, canlıyı öldürmeksizin yapılan incelemeye vital inceleme denir.

  • Tek hücreli organizmalar ( parazitler vs)
  • Kan
  • Lenf
  • Semen
  • Serebrospinal sıvı
  • Synovial sıvı gibi dokulara uygulanır.
  
Hücre içeren sıvıdan bir damla alınır ve bir lam üzerine damlatılır, üzeri basınç uygulanmadan bir lamelle kapatılır hemen mikroskop altında incelenir. Bu yüzden faz-kontrast mikroskop kullanarak veya boyanarak incelenirler.
  Bu amaçla vital boyalar kullanılır. Vital boyalar az toksiktir ve hücreyi öldürmez. Özellikle ilgi duydukları hücre yapıları üzerine oturarak onları seçilebilir hale getiriler.
  Derialtı bağ dokusu, kas ve sinir lifleri, epitel kazıntıları gibi yumuşak yapılardan alınan biopsi örneklerine de canlı inceleme uygulanır. Alınan örnek bir lam üzerinde ince uçlu iğnelerle tiftiklendikten sonra üzer, hemen bir lamelle kapatılır ve mikroskopta incelenir.
 
  B) Cansız(Ölü) İnceleme 
  Doku ve organlardan alınan örnekler histolojik teknikler kullanılarak preparat haline getirilir ve mikroskop altında incelenir.
  Alınan doku örnekleri preparat haline gelinceye kadar bir takım aşamalardan geçirilir. Bu aşamalar;
  1. Dokunun alınması
  2. Tespit (Fiksasyon)
  3. Yıkama (Tespit maddesinin uzaklaştırılması)
  4. Dehidrasyon (Suyunu giderme)
  5. Parlatma (Clearing, Şeffaflandırma)
  6. Emdirme
  7. Gömme (Embeding) ve Bloklama
  8. Kesme
  9. Kesitleri lam üzerine alma
  10. Kesitleri boyama
  11. Kapatma
  1) Dokunun Alınması
  Deney hayvanlarından anestezi altında veya öldükten sonra en kısa sürede alınan doku ve organ parçaları önce bisturi veya jilet yardımıyla küçük parçalara(3-4mm) ayrılır ve tespit sıvısına konur.
  İncelenen doku örneklerinin ölümden sonra en kısa sürede tespit sıvısına konması önemlidir.
  Hücre öldükten sonra bir takım kimyasal değişikliklere uğrar ve otoliz olur.
  Buna postmortem (ölüm sonrası) dejenerasyon denir.

  2) Tespit(Fiksasyon)
  Postmortem dejenerasyonları önlemek için doku örneklerinin en kısa sürede uygun kimyasal veya fiziksel işleme tabi tutulmasıdır.
  Fiksasyonun Amacı
  • Hücre veya dokuları canlıdaki haline en yakın şekilde sabitlemek.
  • Otoliz, bakteriyel bozulma ve çürümeyi önlemek.
  • Kolaylıkla difüzyon olan maddelerin kaybını önlemek.
  • Dokuyu mikrotomda kesilebilecek sertliğe kavuşturmak.
  • Dehidrasyon, şeffaflandırma, parafine gömme gibi zararlı işlemlere karşı dokuyu koruma.
  • Dokunun histokimyasal boyalarla kolay boyanmasını sağlama.
  • Eğer doku parçası içinde bakteri, virüs ya da mantar gibi herhangi bir hastalık etkeni varsa onu öldürerek araştırmacı için zararsız hale getirmek.
  İki çeşit fiksasyon yönetmi vardır; fiziksel fiksasyon, kimyasal fiksasyon.

  a) Fiziksel
  Kuturma   --   Dondurma   --   Isı

  b) Kimyasal
  Formaldehit, Osmik asit, Pikrik asit, Asetik asit, alkol, kloroform, potasyum bikromat, merkürik biklorid, aseton.

  Kimyasal fiksasyon iki şekilde yapılır.
  • İmmersiyon Yöntemi
Alınan örnekler fiksatife atılır.
  • Perfüzyon Yöntemi
Hayvan anestezi altında iken oranı besleyen arter yolu ile önce serum fizyolojik ardından fiksatif verilirek. 

  İyi Bir Fiksatif Özellikleri:
  • Dokuyu en kısa sürede tespit etmeli, postmortem değişimleri (otoliz) önlemeli.
  • Dokuya en az hasarı vermeli.
  • Dokuyu sertleştirerek kesilmesini kolaylaştırmalı.
  • Dokuya bakteriyel üremeyi önlemeli.
  • Dokunun boyanmasını kolaylaştırmalı ve iyi bir görüntü sağlamalı.
  3) Yıkama
  Tespit edilen doku parçalarından tespit maddesini uzaklaştırmak için yıkama yapılır. Uygulanan tespit maddesi çeşidine göre su veya farklı yoğunluklarda alkol ile yapılır. Formalin, osmiyum tetraoksit ve krom tuzu içeren tespitlerden sonra, doku akar su altında ( çeşme suyu) yıkanarak uzaklaştırma yapılır. Doku parçaları tespitten sonra 12 saat civarı akar suda yıkanır. 

  4) Dehidrasyon (Suyu Giderme)
  Yıkama işleminden sonra dokudaki su miktarı çok fazla artar. Parafine gömülecek dokuların içerisinde hiç su olmaması gerekir. Bu sayede parafin dokuya tamamen nüfuz eder.
  Dokudaki suyu en iyi çeken madde alkoldür. En yaygın olarak etil alkol kullanılır.
  %50lik derişimden başlanarak, 70-80-96-10lük etil alkolden geçirilerek sudan arındırılır.
  Yıkama işlemi alkolle yapılmış ise dehidirasyona yıkama yapılan alkolün derecesinden başlanır.
  Dehidrasyon süresi dokuya göre değişiklik gösterir genel olarak, her alkol derecesinde 2 saat kalır.
  Doku alkolde çok uzun süre kalırsa çok fazla sertleşir.

  5) Parlatma (Saydamlaştırma, Şeffaflandırma)
  Parlatmanın asıl amacı dokuya nüfuz etmiş olan alkolü uzaklaştırarak ışığı kırma indeksi daha yüksek olan ve hem alkolü hem de parafini eritebilen bir sıvı ayıracın konmasını sağlamaktır.
  • Işık Mikroskobu İçin: Ksilol, toluen, sedir yağı, eter, kloroform veya metil benzoat
  • Elektron Mikroskobu İçin: Propilen oksit kullanılır.
  En yaygın kullanılan ksiloldür. Ksilol aynı zamanda dokuyu saydamlaştırır.
  Doku 3 ayrı ksilol kabında birer saat kalır.
  
  Uygun Bir Şeffaflaştırıcı Özellikleri:
  • Alkolü en kısa sürede uzaklaştırmalı.
  • Dokulara nazik olmalı.
  • Toksik olmamalı.
  • Ekonomik fiyatlı olmalı.
  • Erimiş gömme materyali ile geçimli olmalı ve kolay uzaklaştırılabilmeli
  • Güvenilir olmalı.

  6) Emdirme (Sertleştirme, İnfiltrasyon)
  Şeffaf duruma gelmiş doku parçaları erimiş parafin, plastik madde, jelatin, epon, epoksirezin veya selloidinden birinin içine koyularak bu madde emdirilir.
  Amaç şeffaflaştırıcıyı dokudan uzaklaştırmaktır.
  Böylece emdirme, gömme maddesinin dokulara iyice nüfuz etmesine yardımcı olur.
  En çok kullanılan emdirme maddesi parafindir.
 
  7) Gömme (Embeding) ve Bloklama 
  Bu aşamanın amacı emdirme maddesi dokuların içine iyice nüfuz ettikten sonrai dokuları yarı sert ve kolay kesilebilen gömme maddesi içerisine yerleştirmek ve böylece kolay taşınan ve parçanın kolayca kesilmesini sağlayan bloklar elde etmektir.
  Özel kalıplar içine sıvı haldeki parafin doldurulur ve kesit yüzeyleri alta gelecek şekilde doku parçaları yerleştirilir. Donmaya bırakılır.

  8) Kesme
  Bloklar mikrotom adı verilen özel bir aletle 5-7 mikrometre kalınlığında kesilir.
  Mikrotomlar; Kızaklı(bıçak hareket eder), Rotatif(blok hareket eder), Dondorma olarak üçe ayrılır.
  Elektron mikroskobik kesitler için ultramikrotom kullanılır. 0.02-0.01 mikrometrelik kesitler elde edilir.
  Mikrometre milimetrenin binde biridir.

  9) Kesitleri Lam Üzerine Alma
  İncelenecek doku parçalarından elde edilen ince dilimlere kesit denir. Kesitler bir fırça ile 37 'C lik su banyosuna alınır. Böylece kesitler ısının tesiri ile açılırlar ve parafin erir. Sonra lam üzerine alınarak kurumaya bırakılırlar.

  10) Kesitleri Boyama (Staining)
  Lam üzerine alınan kesit henüz incelenecek halde değildir. Çünkü boyanmamış preparatlarda doku elemanları renksizdir. Bunun için boyanması gerekir. 
  Histolojide rutin olarak kullanılan en basit boyamada, hücrelerin iki temel öğesi yani çekirdek ve stoplazma ayrı özellikteki boyalarla boyanır ve şekilli oluşumlar, mikoskop altında görülebilir olur.
  Çekirdek hematoksilenle(bazık) mavi-mor renge, stoplazma eozinle(asidik) kırmızı-pembe renge boyanır.
  Boyalar suda veya alkolde çözünen ve anyon katyonlarına ayrılabilen tuzlardır. Eğer boya taşıyıcı organik grup katyon ise buna katyonik(bazik) boya, anyonda ise buna anyonik(asidik) boya denir.
  Bazik boyalarla boyanan hücre elemanlarına (çekirdek) bazofilik, asidik boyalarla boyanan elemanlara (stoplazma) ise asidofilik denir.
  Bazik boyalar dokudaki negatif yüklü kısımlar tarafından, asidik boyalar ise pozitif yüklü kısımlar tarafından tutulur.
  Boyalar genellikle ortokromatiktir. Yani, dokunun tamamı boyanın rengini alır. Ancak, bazı bazik boyalar hücrenin içindeki iyonize fosfat ve sülfat gruplarıyla (plazmadaki GER, kıkırdak doku ara maddesi, mast hücresinin heparin içeren granülleri gibi) polimerize olurlar ve agregat oluştururlar.
  Dokuları veya doku elemanlarını boyanın normal renginden farklı bir renge boyarlar. Bu olaya metakromazi, bu boayalara da metakromatik boyalar denir.
 
Toluidin Mavisi örneği
Bunlar toluidin mavisi (mor menekşe rengine dönüşür), thinonin, metilen mavisi, azure A gibi bazik ve anilin boyalardır.






  PAS Boyama (Periyodic Acid Shift)
  Karbonhidratların ve karbonhidrat bakımından zengin makromoleküllerin gösterilmesinde kullanılır. Bu kısımlar, koyu pembe- mor renkte görülür.
  Hücrelerdeki glikojeni, çeşitli hücre ve dokulardaki mukusu, epitel altında bulunan bazal membranı ve bağ dokusundaki retiküler fibrilleri göstermek için kullanılır.

  Lipidler
  Sudan III, Sudan IV ve Oil Red 0 ile kırmızıya,
  Sudan Black ve Osmiyum tetraoksitle siyaha boyanır.

  11) Kapatma
  Boyanmış preparatların uzun süre rengini koruyabilmesi ve saklanabilmesi için kapatılması gerekir.
  Kapatıcı madde olarak kanada balzamı ve entellan kullanılır.
  Lamın üzerindeki renklendirilmiş dokuya bir damla kapatıcı madde damlatılır ve üzeri uygun bir şekilde kuvvet uygulamadan kapatılır. Lam 45 derecelik açıyla bırakılır, eğer içeride hava kaldıysa dokuya zarar vermeden hafifçe bastırılır.